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苦行僧的博客  
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老虎机和分子生物学(15) 一支破试管引起的科学革命 2019-02-09 18:01:48

      在Luria-Delbruck实验中,Luria发现即使是细菌这类连细胞核都没有的微生物也有自己的基因,而且这些基因可能随机地发生突变。遵寻达尔文的"自然选择"的机制,环境因子(如噬菌体的存在)可以定向地选择出对其具有抗性的突变菌株。这篇论文成为了细菌遗传学的经典。

      利用相类似的方法,Luria于1944年进一步单独发现:即使噬菌体这种被Delbruck视为"生物界的原子"、没有完整的细胞结构、只有寄生在宿主体内才能完成自我复制、被认为是"基因的最小单位"、"仅由蛋白质组成的大分子复合物"(当时无人知道噬菌体内有核酸)也有自己的基因,而且还会发生突变。发生在噬菌体上的突变可以影响它们在不同细菌类型中的寄生能力(即宿主范围)。过篇文章开辟了另外的一个新的研究领域一一一病毒遗传学。

      在研究这些细菌和噬菌体的基因突变时,Luria发现一个奇怪的现象:正常情况下,T2和T6可感染大肠杆菌B菌株后,会导致细菌裂解并释放出大量新的T2和T6噬菌体。然而,当T2和T6噬菌体感染一种被称为B/4o的菌株一一一一种大肠杆菌B菌株的变种一一一时,T2和T6噬菌体可以正常地吸附到B/4o细菌的表面,在显微镜下也可以观察到被感染的B/4o细菌很快就发生了裂解,然而利用这些B/4o细菌裂解液来感染大肠杆菌B菌株时,没有任何噬菌斑产生。仿佛T2和T6噬菌体在感染B/4o细菌并导致B/4o裂解后后,却没有产生新的T2和T6噬菌体,或者产生了失去正常功能的噬菌体。

      这一困惑着Luria的新现象终于由于一次失败的实验而得到了解决一一一也就是Luria自己介绍的一支幸运的破试管和限制性内切酶的故事。

      一天早晨,已经从印地安那大学转到伊利诺伊大学(University of Illinois at Urbana–Champaign)工作的Luria来到实验室时发现,前一天晚上一支用来培养对T2和T6噬菌体敏感的大肠杆菌菌株的玻璃试管破了。为了不浪费其他同时准备的实验材料,Luria向自己的研究助理Giuseppe Bertani要了一管志贺氏菌(Shigella)来代替。

      大肠杆菌(E. coli)和志贺氏菌(Shigella)是两种完全不同的菌种。虽然Luria预测志贺氏菌可能得到与大肠杆菌相似的结果,然而这一次阴差阳错的失误却给他带来了一个巨大的惊喜。

      虽然T2和T6噬菌体感染B/4o细菌后导致了B/4o的裂解,但利用传统的感染大肠杆菌B菌株的方法,Luria没有在裂解液中检测到T2和T6噬菌体的存在。然而这些"没有噬菌体"的B/4o裂解液可以感染并裂解志贺氏菌,说明B/4o裂解液中确实存在大量的T2和T6噬菌体,只是在感染B/4o后,B/4o菌株中存在的某种因子对T2和T6噬菌体进行了某种修饰(Modification)后成为变异的T*2和T*6噬菌体。大肠杆菌B菌株具有某种特殊的能力限制(Restriction)这种在B/4o突变菌株中修饰过的T*2和T*6噬菌体对B菌株的感染,因而无法在B菌株中增殖并导致其裂解。

      然而,这种经过B/4o菌株修饰过的T*2和T*6噬菌体可以像正常的T2和T6噬菌体一样感染和裂解志贺氏菌。更有趣的是,这种修饰过的T*2和T*6噬菌体感染志贺氏菌后,释放出来的噬菌体似乎又恢复了正常一一一即重新获得了感染大肠杆菌B菌株的能力,说明经过B/4o菌株修饰过的T*2和T*6噬菌体丧失的感染大肠杆菌B菌株的能力的这种性状是不能遗传的,不是由基因突变造成的。

      生物学界的这一重要现象就这样由于偶然的一支破试管而在1952年被由Luria发现。从此,这一发现一直困扰着科学家们,直到十多年后一位后来在梵帝冈科学院拥有崇高地位的瑞士科学家Werner Arber从"噬菌体帮"那里学习噬菌体技术,并从Giuseppe Bertani慷慨赠送的大肠杆菌菌株中分离出限制性内切酶。现在我们大家都知道,作为保护自己不受病毒的感染的一种自我防卫的方式,细菌体内会产生某些DNA内切酶,将入侵的病毒DNA剪切和破坏掉。由于病毒DNA和细菌DNA一样都是由A、T、C、G四种碱基组成,不同的菌株中表达一种称为甲基转移酶的蛋白质,将自身的DNA进行甲基化标记,从而让自身的限制性内切酶在切除入侵的未经甲基化修饰的病毒DNA的同时不会伤及细菌本身。

      由此推理(请有兴趣的读者自行查阅),Luria发现的大肠杆菌B/4o突变菌株中应该是其甲基转移酶发生突变的结果。从由于B菌株的甲基转移酶是正常的,从B菌株裂解释放出来的T2和T6噬菌体的DNA是被甲基化修饰过的。当正常的T2和T6噬菌体感染B/4o菌株后,新合成的异常的T*2和T*6噬菌体DNA没有被甲基化修饰。当从B/4o菌株T*2和T*6噬菌体再次感染B菌株时,其DNA会被B菌株产生的限制性内切酶剪切掉,无法再感染B菌株。由于甲基化转移酶和限制性内切酶都是由细菌的基因决定,所以发生在噬菌体上的变化是无法遗传的。从严格意义来讲,Luria 发现的"Modification"其实应该称为"Demodification"。

      由于每种限制性内切酶都只能剪切DNA中特定的碱基序列,因此成为分子生物学和基因工程中的一个重要工具,让人类克隆基因成为可能,直接导致了基因工程这一学科的发展和在工业中的广泛应用。

      从Gregor Mendel提出遗传因子的概念,到Thomas H. Morgan利用传统的杂交技术将基因在染色体上进行定位,到Max Delbruck提出基因是一种分子,进而由Oswald Avery和Alfred Hershey等证明基因的分子属性是DNA以来,限制性内切酶的发现更直接推动了生物学上的一场工业革命,让人类可以通过基因工程的方式来改变某种生物的基因。在这一场革命中,发现这一现象并提出"修饰和限制"的概念的Luria是当之无愧的领军人物。




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老虎机和分子生物学(14) 寻找华森 2019-01-19 10:58:07

       因为发现DNA双螺旋结构而闻名于世的华森和克里克对于学习生物学的中国学生来说并不陌生,虽然大家并不一定知道他们的全名为James Dewey Watson和Francis Harry Compton Crick,更不知道这样一个美国人和一个英国人是怎样走到一起,完成这个被誉为"二十世纪生物学界最重要的发现"的。

      为了让世人更好的了解DNA双螺旋结构的发现过程,Watson写了那本非常有趣而又充满争议的《双螺旋》(The Double Helix)。在书中,Watson详细介绍了怎样在自己的博士生导师Luria的帮助下,获得美国政府的奖学金去丹麦的哥本哈根学习生物化学,以及后来转而去剑桥的卡文迪许实验室(Cavendish Lab)研究DNA结构的过程,这可能是全书中最没有争议的内容之一。除了间接地证实《双螺旋》中描述的自己对Watson的帮助外,Luria在自传中也对自己的第一位、也是最著名的博士研究生Watson作了一些简单的介绍。

      原来,在1947年毕业于芝加哥大学(University of Chicago)时,年仅18岁的Watson为他的天才付出了第一个代价:加州理工学院拒绝了Watson的博士研究生入学申请,因为他太年轻(据Luria推测),退而求其次的Watson最终被印地安那大学的研究生项目录取。在Luria讲授的最后一节《病毒学》课上,Watson向已经因Luria-Delbruck实验而成为科学名星的Luria提出申请,加入他的实验室,开始了X射线照射对噬菌体感染能力影响的研究。

      在得知Linus Pauling于1951年以构建模型的方式解决了蛋白质α螺旋结构(α-helix)的难题后,Watson不再满足于用传统的分析遗传性状的变异及其在后代中传递等传统的方法去研究基因,而是希望用则发明不久的X射线衍射的手段去更直接地研究基因的属性一一一特别是DNA的结构,因为此时的噬菌体帮虽然仍然对Avery的肺炎球菌转化实验的结论有所保留,但已倾向于认为在生物个体间传递遗传信息的就是DNA这种只有四种核苷酸组成的"单调乏味"的物质。

      在Luria看来,研究DNA的结构必需有很好的生物化学基础,而且"一个好的生化学家必需懂很多的化学知识"(Linus Pauling对Luria的告诫)。自认为无法在生物化学领域给予Watson足够的指导,Luria于是将Watson介绍给来冷泉港实验室学习噬菌体课程(由Luria和Delbruck发起开设的)的丹麦生化学家Herman Kalckar,希望Watson能去他的实验室学习生物化学和当时刚刚被应用来研究蛋白质结构的X射线衍射技术。

      由于对在Herman Kalckar实验室的研究兴趣减弱,加上在一次意大利小型学术会议上来自英国国王大学的Maurice Hugh Frederick Wilkins关于DNA的X射线衍射研究方面的报告的激发,Watson决定离开哥本哈根,加入到英国剑桥大学的Cavendish实验室。虽然Herman Kalckar对Watson离开他的实验毫无意见,但由于没有事先获得美国科学奖学金管理委员会的同意,Watson几乎失去资金来源,此时又是在Luria的帮助下重新另一项奖学金的资助,直到他完成构建DNA双螺旋结构模型的工作。

      为了更好地了解为什么Watson从Luria实验室毕业后如此坚定地要去研究DNA的结构,我决定先查阅Watson在Luria指导下完成并发表的论文,希望从中找出一点蛛丝马迹。令人惊讶的是,在以Luria的名义发表的所有文章中,没有一篇的共同作者是Watson。

      难道大名顶顶的Watson没有发表他的博士论文方面的工作?非也!在攻读博士学位期间,Watson在《细菌学杂志》(Journal of Bacteriology)上共发表了两篇论文。Watson在1950年8月的《细菌学杂志》上发表《X射线灭活的噬菌体的特性:通过直接效应的方式灭活(1)》之后,又于1951年发表了《X射线灭活的噬菌体的特性:通过间接效应的方式灭活(2)》一文。两篇文章的注脚上都清楚地标明这是Watson博士学位论文的一部分,研究经费来自美国癌症协会对Luria的资助。从文章的内容来看,整个研究就是在Luria先前发现的不同类型的射线对噬菌体的灭活以及噬菌体自身也会象细菌一样产生突变等研究的延续。然而两篇论文的作者都只有Watson一人。而提供研究经费支持和科学指导的博士生导师Luria没有作为共同作者出现在Watson的研究论文中。

      与Watson发表的博士学位论文署名方式相同,在Luria的指导下,他的另一位学生、后来成为研究斑马鱼的遗传和发育的先驱人物的George Streisinger发现当T2和T4噬菌体同时感染大肠杆菌时会产生具有混合的宿主范围和血清型的新型噬菌体,这是最早的关于噬菌体之间可能发生基因重组的发现之一。当Streisinger的博士论文《T2和T4噬菌体的宿主范围和特异血清反应性状的混合表现》在1956年的《病毒学》(Virology) 期刊上发表时,Luria也不是共同或通讯作者。

      其实,导师的名字不出现在学生的论文中的做法在当时并不普遍,Luria在自传中简单的提到了自己对论文署名的态度和对学生独立研究的支持。Luria的这种对待论文署名的态度,可以直接解释为什么这样一位分子生物学、细菌遗传学和病毒遗传学的奠基人发表的研究论文的数量还不到现某些教授一年发表的论文数目。尽管如此,没有谁能因此否定他对于现代分子生物学发展的巨大贡献。即使是大名顶顶、目空一切、最近因为种族主义的言论而饱受批评的Watson也愿意将自己的著作《基因的分子生物学》的第一版和第二版奉献给自己的老师Luria。

      Luria对待论文署名的这种态度在今天的科学界如果说还没有完全绝种,那也绝对称得上是珍稀物种。现在,论文署名常常沦为利益分配或交换的手段,利用自己的权力一年剥得几十甚至几百篇论文的"名星学者"彼彼皆是,虽然研究成果永远也不会出现在教科书上。但是他们会赢得别人发自内心的尊重吗?也许,他们并不在乎别人的尊重,那此劣质论文带来的利益和一个封闭系统内的仰望才是他们追求的目标。



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老虎机和分子生物学(11) 第三剑客 2018-12-23 09:23:16

      就在与Luria合作研究那篇经典的被称为Luria-Delbruck实验(也称波动测试)的论文时,Delbruck邀请了一位特殊的客人来Nashville参加自己组织的一个小型的学术沙龙(Delbruck刚刚博士毕业时在柏林组织过类似的非正式聚会),并做了题为"噬菌体的免疫反应"的报告。这个客人就是Alfred Day Hershey。Hershey 给Delbruck 留下的第一印象就是:爱喝威士忌和不喜欢饮茶;简单但是击中问题的要害;爱独处,即使在一条船上独自生活几个月都不会感觉寂寞。

      Hershey于1930年从Michigan State College取得化学学士学位后,转而从事微生物学研究并在1934年取得微生物学博士学位。博士毕业后,Hershey以讲师(instructor)的身份加入到位于密苏里州圣路易斯的华盛顿大学的细菌学和免疫学系,和美国第一位从事噬菌体研究的Bronfenbrenner教授(就是前面提到的看到Luria的噬菌体的电镜照片后惊叹"Mein Gott! They’ve got tails!"的那位教授)合作。

      然而,尽管Delbruck、Luria和Bronfenbrenner都是以噬菌体为研究材料,但他们对噬菌体研究的理解却很不相同。如Delbruck认为他和Luria及Anderson合作发表噬菌体的电镜照片论文后,噬菌体的大小这个问题已经解决,下一步应该将精力集中在噬菌体怎样进行自我复制上。Luria倾向于用细菌和噬菌体作为材料,研究基因的突变和遗传的机制(特别是在他们发现细菌和病毒自身都可以产生突变后)。Bronfenbrenner却继续研究噬菌体的颗粒组成。然而,在与Bronfenbrenner合作研究的过程中,Hershey的观点却在向Delbruck和Luria的方向靠拢,这让Hershey很痛苦。更加令人失望的是Hershey和Bronfenbrenner于1943年发表在《微生物学杂志》上的文章"吸附能力弱的噬菌体的逐步释放过程"(Stepwise Liberation of Poorly Sorbed Bacteriophages)只是对Delbruck在加州理工学院的地下室里完成的第一篇噬菌体论文的重复和证明。

       就在Hershey对生活和研究感到悲观之际,Delbruck向他伸出了友谊之手,邀请Hershey到自己的实验室学习自己和Luria建立起来的一套研究噬菌体的基本方法。Delbruck的无私精神无疑深深地影响了Hershey的决定,以致Hershey在1980年代提到Delbruck时仍然充满感激。

      1943年2月3日,收到Delbruck寄来的关于Luria-Delbruck实验的理论部分的手稿。Luria又在Bloomington花了两个月去完成证明Delbruck的理论所需要的实验后,才前往Nashville和Delbruck共同完成了论文的写作,并携带着他们关于细菌的病毒抗性突变的最新进展(Luria-Delbruck实验)一起访问了住在圣路易斯的Hershey,完成了噬菌体帮"三剑客"的第一次正式会议。Luria在自传中回忆,听到他们介绍关于细菌的病毒抗性突变的工作后,安静而且从不喜形于色的Hershey仍然表现出了他特有的兴奋。于是,两个"敌国公民"(enemy aliens)和一个"与社会格格不入的怪人"组成的噬菌体帮的核心"三剑客"开始合力,推动了当时最有活力的研究方向向前发展。

      事实证明,Delbruck热情邀请Hershey加入组成噬菌体帮的核心"三剑客"是一个非常正确的决定,而且回报丰厚。

      首先,它挽救了一个濒临心理崩溃的、对科学研究几乎失去信心的科学家。

      其次,Hershey的教育背景弥补了Delbruck和Luria知识上的缺陷。Hershey-Chase实验完美的实验设计,为证明"DNA是遗传物质"这一科学结论钉上最后一颗钉子。理论物理学家出身的Delbruck不可能做出这么精美的设计。虽然实验能力一流,由于受Linus Pauling"要从事生物化学研究,你必须懂得很多的化学知识"的告诫,Luria也刻意地避免将自己的研究重点转到生物化学上。Hershey的加入不仅带来了Luria和Delbruck所缺乏的化学知识,爱独立思考科学问题个性让他可以更加深入细致地研究Luria和Delbruck发现的、但无法或不愿去研究的新问题。Hershey也是"三剑客"之中唯一坚持到最后还在研究噬菌体的人。

      另外,对于Luria个人来说,Hershey的加入还有另外一层意义。当他在1943年得知Oswald Avery用转化肺炎杆菌(pneumonia balillus)实验证明"遗传物质可能是DNA而非蛋白质"的研究后,自己对"噬菌体的遗传物质是蛋白质而不是DNA"的错误观点仍然坚持了好几年,直到1952年Hershey完成了著名的Hershey-Chase实验。Hershey-Chase实验可以说为噬菌体帮挽回了一点颜面。然而,在George W. Beadle和Edward L. Tatum的"一种基因,一种酶"盛行的40年代,在认为DNA只是由四种碱基组成的"单调乏味"的框架结构的年代,又有谁能指责Luria犯的这种错误呢?

      Luria曾经问过Hershey对于天堂的看法,Hershey的回答是:发现完美的实验,每个实验都能一次成功。的确,加入到噬菌体帮后的Hershey就是生活在这样的天堂里:他不仅做出了"噬菌体在天然状态下是通过将DNA而不是蛋白质注入到细菌体内并复制自己的"这么完美的实验(1952年)。噬菌体帮在1943年4月份完成第一次代表大会后不久,Luria又因为发现同细菌一样噬菌体自身也可以产生突变,而开启了病毒遗传学的研究(1944年)。在此基础上,Hershey发现当两种不同的噬菌体突变株同时感染细菌时,两种噬菌体之间的基因可以发生重组(1958年)。

      出身和教育背景悬殊,性格完全不同的Delbruck、Luria和Hershe能组成噬菌体帮,共同推动分子生物学的发展,的确可以说是一个人间奇迹。


祝大节圣诞节快乐,新年好运连连!




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