本文要点
1. sars-cov-2是实验室生成的；
2. 实验室制造sars-cov-2的主要手段是基因编辑（基因合成也是一种基因编辑）；
3. 首先通过基因合成，得到一个中间病毒--一个嵌合的冠状病毒。这个嵌合病毒的基因序列，相当于是将SARS-CoV的一小段特别的基因序列，“粘贴”到CoVZC45基因序列的对应位置而得到的。
4. sars-cov-2不是单纯的嵌合病毒。对上述嵌合病毒，还需要再做多处基因编辑，这些编辑将利用已有的生物遗传学知识对病毒进行各种针对性优化，使新病毒集自然界多种病毒（包括非冠状病毒）的优异特性于一身，比已有的任何冠状病毒都更强大、更全面，更难以免疫识别，更难以抵御，更难以医治；
5. 功能性的基因编辑完成后，还需对病毒基因序列大体均匀地尝试不破坏既有功能的附加基因修改，尽可能模糊之前所做的人工合成与人工编辑痕迹，使人造病毒看上去象是自然变异产生的。
关于CRISPR/Cas9
2012年，CRISPR/Cas9横空问世，基因编辑技术得以突飞猛进，进入新的时代（第三代）。CRISPR/Cas9号称“基因神剪”，它使之前艰深高难的基因编辑工作一下子变得设计简单，操作便捷、高效可靠起来，其使用门槛、操作难度和成本也都大大降低，到2013年，它被迅速应用到生物、医学、农业、环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，这其中就包括2013年对冠状病毒感染机制的重大发现。CRISPR/Cas9这一利器使基因编辑不再是一种高难技术，如果不考虑法律、安全和伦理、道德等因素，借助CRISPR/Cas9，无论是编辑人类胚胎DNA，还是编辑冠状病毒RNA，都不是一件很困难的事。
实验室合成、编辑sars-cov-2简明教程
0. 注意事项
请在符合安全等级的实验室进行本实验，并严格遵守实验室安全防护规程。
1. 实验目标
我们的目标是制作一个β谱系的冠状病毒，这个病毒后来被称为SARS-CoV-2或新冠或2019-nCoV；
2. 选定基因改造的底版病毒
目标病毒的基因序列将包含近3万个碱基对。作为新病毒的始创者，我们不能像后来的瑞士人那样，从零开始拼装这个新病毒，我们挑选了一个已存在的β谱系冠状病毒CoVZC45作为改造底版，这样可使基因改造工作量最小化。
CoVZC45，这一作为改造底版的类SARS冠状病毒来自2017年采集的舟山蝙蝠，2018年1月，它的基因序列由南京军区军事医学研究所上传至GenBank实现国际共享；目标病毒将与它的底版CoVZC45亲缘关系最为接近，它们将同处冠状病毒β谱系的同一分枝--BB亚群。
3. 选定可人际传播的已知病毒
底版病毒CoVZC45不能感染人，不能使人致病；我们还需要一个可人际传播的冠状病毒，以提供可感染人的基因片断。我们选定的这一病毒是SARS-CoV，即SARS病毒或者说非典病毒。SARS-CoV将为人工病毒提供一把进入人体细胞的“钥匙”。
CoVZC45没有进入人体细胞的钥匙；而SARS-CoV则有与人体细胞受体匹配的钥匙。
冠状病毒的侵染，细胞内复制，释放（扩散）示意图
4. 合成可感染人的中间病毒。
S蛋白，也叫spike蛋白或刺突蛋白，就是图中的红色突起，它的前半部分S1蛋白决定冠状病毒与人类受体（如ACE2）的结合能力。
中间病毒是一种嵌合病毒。简单地说，用sars-cov的S1蛋白中决定与ACE2结合能力的RBD肽段（氨基酸长链），去替换CoVZC45的S1蛋白中的RBD肽段，得到的嵌合病毒，就是我们所需要的中间病毒。CoVZC45的S1蛋白不能与人体ACE2（血管紧张素转换酶2）结合，所以它不能感染人；把CoVZC45的S1蛋白的RBD肽段替换成SARS-CoV的S1蛋白的RBD肽段后，得到的合成病毒，它的S1蛋白就获得了与人类受体ACE2（相当于人类细胞的锁）结合的能力，这意味着，我们已经用CoVZC45和SARS-CoV合成了一种能感染人的新病毒。
这一步工作，相当于用SARS-CoV的对人体有效的钥匙，换掉CoVZC45原有的对人体无效的钥匙，有了好用的新钥匙，合成病毒就能侵入、感染人体细胞了。
如果把S1蛋白看成是打开细胞的钥匙，那么S1蛋白中的RBD（Receptor Binding Domain，受体结合域）肽段，就是钥匙的钥齿部位。RBD肽段在S蛋白中的位置见下图。
上半图：sars-cov-2的病毒序列构成示意图；下半图：sars-cov-2与COVZC45的S蛋白（spike蛋白，刺突蛋白）分解对照及各部分相似度。
5. 编辑中间病毒S1蛋白的RBD区段，对其进行同构替换。
中间病毒来自SARS-CoV的RBD肽段中，有五个重要的氨基酸残基，也就是S蛋白的氨基酸序列中序号为第442、472、479、487、491的五个氨基酸残基，它们位于S1蛋白与人体ACE2的接触界面上，他们的空间位置、空间形态如同钥匙齿面上五个至关重要的“钥齿”，决定着S1蛋白能否与人类受体ACE2（相当于人类细胞的锁）吻合匹配，结合在一起，也决定着病毒能否进入并感染人体细胞。
我们试图在不丧失功能的前提下替换这五个残基。经过反复尝试，我们为五个残基中的前四个找到了替代者，这四个残基被替换后，虽然病毒S1蛋白的五个关键部件中有四个已经变了，但它们的空间结构神奇地与改变前高度同构。实验证明，替换了四个关键碱基的中间病毒仍然可以与人体ACE2良好结合，轻松地侵入人体细胞。也就是说，我们为人造病毒找到了感染人体细胞的新钥匙，这把新钥匙的功效不比原来的钥匙差。
Sars-cov与sars-cov-2，二种病毒S1蛋白的氨基酸序列比照，红色对应相同的氨基酸（残基），白色对应不同的氨基酸（残基）。
可以观察到两点：a）在图示区段，二种病毒相似度很高；b）在442、472、479、487四个位置上，二者的残基不同，这正是上述同构替换带来的改变。
换掉四个关键的氨基酸残基前后，病毒的S1蛋白空间结构、形态高度相似，与ACE2的结合能力被有效保持。
以上的同构替换应该是本次人造病毒实验最为精巧的环节。
2020年2月19日，Science杂志刊发了美国德克萨斯大学奥斯汀分校Jason S McLellan团队的一篇重磅论文《Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation》，其中的两个发现是：
a. sars-cov-2与SARS病毒，表面刺突糖蛋白（S蛋白）结构上存在差异，但整体上看相似度很高；
b. 经过计算，sars-cov-2的S蛋白与人类血管紧张素转化酶2（ACE2）的亲和力，是SARS病毒S蛋白与ACE2之间亲和力的10到20倍。这应该是新冠病毒的传染性如此之强的原因之一。
2020年5月17日，澳大利亚弗林德斯大学的一个科学家小组在对比了Sars-cov-2与人体ACE2，与某些动物ACE2的亲和性之后指出：sars-cov-2与人体ACE2的结合力，强过与可能的原始宿主动物（如蝙蝠）ACE2的结合力，也强过与可能的中间宿主动物ACE2的结合力；他们认为，这违反了病毒与新宿主的初始亲和力应低于原宿主的常识。从他们的研究结果看，Sars-cov-2不象是来自动物，更象是专门为人类量身定制的。
6. 在S1、S2蛋白交界处精准插入超级强大的酶切位点
对S蛋白的第三项重大编辑是：在它的两个亚基S1和S2对应的氨基酸序列的交界处，精确地“塞进”一个多碱基酶切位点，这个酶切位点由四个氨基酸“RRAR”（对应12个碱基）构成。
所“塞入”的这个“RRAR”序列符合Furin酶切位点的识别模式“RXXR”，可以被人类的弗林（furin）蛋白酶和其他蛋白酶识别，这些蛋白酶可以自此酶切位置对病毒的S蛋白进行切割，使刺突蛋白（S蛋白）的S1亚基与S2亚基分离。S1蛋白在细胞外被切割脱落后，S2蛋白将与人体细胞膜直接接触，同时，病毒包膜也将紧贴人体细胞膜，二膜之间将发生“膜融合”，“膜融合”后，病毒包膜内的病毒RNA将被直接释放入人体细胞，病毒RNA可立即在人体细胞内自我复制，组装新病毒。
“膜融合”后直接向细胞内释放病毒RNA示意图
sars-cov没有酶切位点，它不能在细胞膜外侧与细胞膜发生膜融合；其S1蛋白与人类ACE2结合后，它将被整体“胞吞”入人类细胞，它的病毒RNA要等到S1、S2蛋白、包膜蛋白在细胞内被蛋白酶分解、溶化后，才能够释放出来，才能开启在细胞内自我复制，组装新病毒的过程。即，sars-cov感染细胞的过程是：
S1蛋白与人体细胞受体ACE2结合==>病毒被整个“胞吞”（囫囵吞枣）入人体细胞==>病毒的S1、S2蛋白，包膜蛋白在细胞内被蛋白酶分解、溶化==>病毒RNA被释放出来==>RNA复制，组装新病毒。
SARS-CoV“胞吞”与SARS-CoV-2“膜融合”对照图
不难理解，sars-cov-2的“膜融合”感染方式，比sars-cov的“胞吞”感染方式，效率要高得多。
加入酶切位点，是sars-cov-2的一项重大功能优化，它的第一个重大效果是：赋予了sars-cov-2比sars-cov强得多的感染力、致病力、扩散力。
2020年2月4日，南开大学高山、阮吉寿等在中国预印本论文平台ChinaXiv发表了一篇题为《武汉2019冠状病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位点》的论文，这篇论文指出：此前发现的所有SARS和SARS样（SARS-like）冠状病毒都不具备新冠病毒（sars-cov-2）的酶切位点，这可能增强了新冠病毒的传播能力。2019-nCoV（即SARS-CoV-2）的侵染效率是SARS-CoV的约100到1000倍。
酶切位点在β谱系冠状病毒中极为少见，SARS-CoV，CoVZC45等病毒都没有酶切位点，β谱系冠状病毒中唯一具有酶切位点的是鼠肝炎冠状病毒；所有与SARS-CoV-2刺突蛋白序列同源性大于40％的病毒都没有弗林（furin）蛋白酶切割位点；有网友估算，CoVZC45恰在S1、S2蛋白交接处自然变异出furin酶切位点的几率小于10的负60次方！以上多重证据证明，SARS-CoV-2的酶切位点不可能是自然变异产生的。
病毒界具有酶切位点的病毒，最著名的当属HIV（艾滋病病毒）和埃博拉病毒。酶切位点在HIV、埃博拉等病毒致病机理中发挥的巨大作用，让我们无法克制在人造病毒中加入酶切位点的冲动。
到这里，就要说说酶切位点赋予人造病毒的第二个重大能力了：和HIV、埃博拉病毒一样，该人造病毒也能重创人体免疫系统。机理是，当sars-cov-2和T细胞（人体的主要免疫细胞）接触时，sars-cov-2能够借助高效的膜融合，侵入、摧毁T细胞，从而破坏人体免疫系统。这一能力当然也是sars-cov所不具备的。
4月7日，上海复旦大学研究组和纽约血液中心研究员姜世勃在论文医学专刊《细胞分子免疫学》联合发表的论文指出：
sars-cov-2会破坏免疫系统，使患者无法抵抗感染；
当sars-cov-2和T细胞相互接触时，sars-cov-2将通过病毒膜和细胞膜的附着，将自己的RNA基因输入T细胞，最终导致T细胞毁坏；
与HIV不同的是，sars-cov-2可能和T细胞一起死亡，进入T细胞的sars-cov-2不会扩散到T细胞外。
7. 在S蛋白中加入O-连接型聚糖结构，使病毒获得逃避免疫打击能力
我们还在这次基因改造病毒中加入了一个O-连接型聚糖结构。这一结构将和细胞表面的蛋白质相互作用，产生一个“粘蛋白样结构域”，“粘蛋白样结构域”能为sars-cov-2提供逃避人体免疫系统打击的糖链屏障。籍着这一屏障，sars-cov-2可以隐蔽、持续地在人体内潜伏、复制，几乎无所不至地向各个器官扩散，直至爆发；籍此，病毒还获得了强悍的人体内适应生存能力，既能大大延缓人体触发免疫反应，又难以被人体彻底清除或根除。
加入酶切位点和O-连接型聚糖结构，使sars-cov-2同时拥有了破坏人体免疫系统和逃避人体免疫系统打击的双重能力，为其强大致病力提供了双保险。
O-连接型聚糖结构也是SARS-CoV或CoVZC45所不具备的。我们加入这一结构，是对埃博拉病毒类似结构的模仿。
8. 在N蛋白中加入非结构蛋白3A，进一步完善病毒免疫逃避能力。
非结构蛋白3A能使核衣壳蛋白（N蛋白，Nucleocapsid蛋白）具备VSR（RNAi抑制子）活性，使其可以有效对抗和反抑制由shRNAs（短发夹RNA）或siRNAs（小分子干扰RNA）触发的RNAi（RNA干扰）。在N蛋白中加入非结构蛋白3A后，RNAi这类通过干扰、抑制病毒RNA来促使病毒降解的免疫疗法可能对SARS-CoV-2失效，这意味着，SARS-CoV-2的免疫逃避能力更多元和全面了。
酶切位点，O-连接型聚糖结构，非结构蛋白3A，集三大利器于一身。我们为SARS-CoV-2设计了全方位的抗免疫能力。
加入非结构蛋白3A，借鉴自中国科学院武汉病毒研究所2017年6月发表的一篇关于RNA干扰（RNAi）的论文，该论文研究、介绍了非结构蛋白3A的功能。
9. 对CoVZC45的辅助因子nsp7和E蛋白，不作任何编辑、改动
这是基于如下考虑：一，目前没有修改二者的功能需要，不能没事找事；二，我们对冠状病毒的了解还远没达到透彻的程度，虽然已知，E蛋白同M蛋白、N蛋白一样，都在正确组装并释放病毒过程中发挥重要作用，但目前，我们对E蛋白的工作机制还缺乏深入了解，以不作改动为宜。三，二者的基因序列都比较短，越短，反而修改难度越大。
E蛋白（包膜蛋白）对应的基因序列位置及E蛋白在病毒体上的位置
nsp7辅助因子对应的基因序列位置
10. 在人造病毒基因序列中尝试其它无碍功能的修改
这些修改必须遵循以下规则：不能与之前的改造工作发生冲突；不破坏既定既有的病毒功能；改动之处在病毒基因序列中大致均匀地分布。
这些修改将有助于使病毒基因序列中的“变异”表现得比较平均、随机、自然，模糊化之前的人工合成、编辑痕迹，使病毒看上去象是自然变异，自然演化产生的。
实事求是地说，现阶段我们确实无法将病毒实现得足够天然，那将带来至少倍增的难度、工作量和时间。而且，有些修改并不是独立的，有可能举一发而动全身。在有限的时间内不可能尽善尽美，过度追求完美，结果将是什么都做不成。
11. SARS-CoV-2带有实验室载体pShuttle的核苷酸序列INS1378
SARS-CoV-2的基因序列中，有一个长度为1378的核苷酸序列INS1378。它来自实验室多功能载体pShuttle SN vector，是病毒制备、实验过程中，将病毒与载体质粒重组时带入病毒基因序列的。我们未能妥善地从SARS-CoV-2中消除这一明显的实验室痕迹。
12. SARS-CoV-2与底版病毒CoVZC45的一致性及差异分析
SARS-CoV-2与底版CoVZC45（舟山蝙蝠类SARS病毒）各部件的一致性情况如下：
E蛋白（及非结构蛋白nsp7亚基）的一致性是100%，
M蛋白（membrane膜蛋白）一致性是98.6%，
N蛋白（Nucleocapsid核壳蛋白）一致性是94%，
S2蛋白（spike刺突蛋白的后半部分）一致性是95%，
S1蛋白（spike蛋白的前半部分，决定病毒与人类ACE2能否结合的部分）的一致性（仅）为69%（因为我们对S1蛋白所做的嵌入、编辑最多啊）。
以上的一致性分布有二点明显反常之处：
a. S蛋白的两个亚基S1，S2分别发生了5%和31%的变异，但与S蛋白相邻的E蛋白却没有任何协调性变异，这在自然演化情况下几乎不可能发生。
b. 自然进化情况下，祖先（CoVZC45）与后代（SARS-CoV-2）之间基因序列上的差异应该大致均匀地分布，相对协调地产生，不应该出现仅某个部分大量变异，而其余部分都高度稳定的情况。其他所有蛋白的一致性都>=94%，唯独S1蛋白的一致性仅为69%，如此突兀的“自然变异”，在自然界很难找到先例。
===教程 End===
基于现有公开信息，从基因编辑之外的其它角度，我们同样可以明确断言：SARS-CoV-2是非自然产生的。请参阅我的上一篇相关文章“sars-cov-2（新冠）是实验室生成的”。
真相不会一直被遮掩。
最有力量的语言是真相。
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