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新冠中的跨物种、跨生物界、超生物基因 3 2024-01-01 04:20:39


巧合太多了,就不再是巧合了。

接续:新冠病毒中的跨物种、跨生物界、超生物基因 2



I SARS-CoV-2对冠状病毒基因的继承、借鉴、模仿、优化、集成(续二)


MHV-JHM、MHV-3、FIPV、FECV,及S1/S2处的多重借鉴

FCS:furin cleavage site,furin切割位点或furin酶切位点。furin(弗林)是一种在人体中几乎无处不在的前体蛋白转化酶(proprotein convertase),furin也广泛存在于脊椎动物和部分无脊椎动物组织、细胞中。

SARS-CoV-2 S1/S2处的furin切割位点(FCS)使其Spike蛋白可在细胞外被furin等人体蛋白酶高效切割,使Spike的膜融合亚基--S2亚基暴露、激活,介导病毒包膜与细胞膜直接膜融合,膜融合后向细胞质中释放包膜内的病毒RNA,第一时间启动复制,大幅提升了感染、复制效率,大幅扩展了在人体内的组织向性(tissue tropism)和感染范围,大幅增强了致病能力。furin蛋白酶在人体中几乎无处不在,S1/S2处的高效FCS是SARS-CoV-2具有泛组织、泛器官感染、侵犯能力并造成广泛后遗症的关键结构因素。

注:SARS-CoV-1的Spike没有FCS,不能在细胞外被水解切割(除非在有胰蛋白酶的肠道中),它的病毒包膜不能直接与细胞膜发生膜融合。完成受体结合后,SARS-CoV-1将被整体内吞,内吞后其Spike需要在在内吞体或溶酶体中被细胞内的组织蛋白酶B或L(CatB/L)水解切割,而后,病毒包膜再与内体膜或溶酶体膜发生膜融合以释放病毒RNA,至此病毒才有机会启动复制。

S1/S2处,指冠状病毒Spike蛋白S1亚基(受体结合亚基)、S2亚基交界处。


1、RRARR借鉴


SARS-CoV-2 S1/S2处的基本furin切割序列RRAR(精氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸)借鉴自小鼠肝炎病毒MHV-JHM、MHV-3株系,以及猫冠状病毒(FIPV、FECV)某些病毒株等病毒S1/S2处的furin切割序列RRARR、RRAR。

基本furin切割序列,也叫最小furin切割序列,指符合“RXXR”模式的四氨基酸序列,该模式的首尾氨基酸都是精氨酸。R是精氨酸的单字母缩写。

SARS-CoV-2 S1/S2处的PRRA插入及由此产生的RRAR切割序列

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SARS-CoV-2 Spike蛋白构成,S1/S2处的RRAR FCS/切割序列

SARS-CoV-2 RRAR切割序列的最后一个精氨酸R是S1亚基的最后一个氨基酸(残基),其后的丝氨酸S是S2亚基的第一个氨基酸(残基),furin蛋白酶将在这两个氨基酸之间水解、切割Spike蛋白。蛋白质、多肽中的氨基酸形成肽键相连时会释放2个H原子和一个氧原子,其剩余部分称为氨基酸残基。为方便,本文将忽略氨基酸残基与氨基酸的严格区分,将氨基酸残基也称为氨基酸。

S2'是SARS-CoV-2 Spike蛋白的另一个蛋白酶切割位点,它位于S2亚基融合肽(fusion peptide,FP)之前,具有二元氨基酸切割序列KR(赖氨酸-精氨酸)。

小鼠肝炎病毒MHV-JHM株系、MHV-3株系S1/S2处的复合furin切割序列皆为RRARR,它包含两个基本furin切割序列:RRAR、RARR,前者就是SARS-CoV-2 S1/S2处的基本furin切割序列。


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几个MHV株系S1/S2(“|”)处的aa序列

小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)有超过25个株系,其中多个株系S1/S2处存在FCS,S1/S2处切割序列为RRARR的MHV-JHM、MHV-3是毒力(致病能力)最强、次强的两个MHV株系。MHV-JHM也叫MHV-4。

猫冠状病毒(Feline CoV)包括FIPV、FECV两个分支。FECV指猫肠道病毒(feline enteric coronavirus),毒力通常较温和;FIPV指猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus),毒力强烈。FECV会突变为FIPV并变得致命。FIPV也称为猫冠状病毒I型(FCoV-1), FECV则称为猫冠状病毒II型(FCoV-2)。
 
FIPV、FECV S1/S2处的aa序列(amino acid sequence,氨基酸序列)较为多变,某些FIPV、FECV毒株S1/S2处也具有furin切割序列RRARR或RRAR。

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某些FIPV病毒株S1/S2处的RRARR、RRAR切割序列


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某些FECV病毒株S1/S2处的RRARR切割序列

SARS-CoV-2是β谱系B支系(乙型冠状病毒属Sarbe亚属)冠状病毒,MHV是β谱系A支系(乙型冠状病毒属Embe亚属)冠状病毒。虽然同属β谱系,但SARS-CoV-2与MHV结构差异巨大、演化距离极远。SARS-CoV-2、MHV-JHM全基因组序列(核苷酸序列)仅有23%具有可比对性(即二者77%的序列几无相似之处),23%可比对部分的一致度仅为66.79%;SARS-CoV-2、MHV-JHM二者Spike蛋白aa序列有92%可比对,但可比对部分的一致度仅为36.65%。

猫冠状病毒(FIPV、FECV)是α谱系(甲型冠状病毒属)冠状病毒,与SARS-CoV-2演化距离更为遥远。冠状病毒共分四个谱系(属)。

SARS-CoV-2 S1/S2处的RRAR切割序列不太可能自然来自MHV-JHM、MHV-3、FIPV、FECV等病毒S1/S2处的RRARR或RRAR切割序列,SARS-CoV-2不太可能源自这些病毒的自然演化,或与其它病毒的自然重组。

科学界在病毒中插入furin切割位点/furin切割序列,或改造、替换病毒中furin切割序列的历史超过了25年。

疫情前的多项研究表明,RRARR是水解切割效能极佳的furin切割序列。早在1995年12月(01 Dec 1995),荷兰莱顿大学(Leiden University)医学院微生物学院病毒学系已对MHV-JHM、MHV-A59 S1/S2处的furin切割序列进行了改造、替换、对比研究,并实验证明,RRARR的切割效果显著高于MHV-A59的furin切割序列RRAHR,RRARR将导致更高比例的Spike蛋白被furin蛋白酶水解切割。H是组氨酸的单字母缩写。

相关论文:
Mutational Analysis of the Murine Coronavirus Spike Protein: Effect on Cell-to-Cell Fusion
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682285700566
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7131709/pdf/main.pdf

作为RRARR一部分的RRAR也是非常高效的furin切割序列。疫情发生后,华中科技大学同济药学院发表于October 05, 2020的一篇iScience论文实验证明:SARS-CoV-2的“RRAR”基序(motif)是一个非常高效的furin酶切序列,它很容易被furin蛋白酶识别和水解,相比经典的furin酶切序列RVRR,RRAR在furin蛋白酶作用下的水解、裂解效率是RVRR的2倍。

相关论文:
Furin:  A Potential Therapeutic Target for COVID-19
https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30834-8

S2589-0042(20)30834-8_gr7_lrg_50p_A.JPG

分别含有RRAR、RVRR切割序列的多肽的水解效率对比图

RFU:Relative Fluorescence Units,相对荧光单位/相对荧光强度

RVRR是发现于土耳其的一种H7N1高致病性禽流感病毒毒株的furin切割序列,高致病性流感病毒通常具有高效的furin切割序列。

另有论文实验表明,除furin蛋白酶外,SARS-CoV-2 S1/S2处的furin切割位点/切割序列还可被多种其它蛋白酶高效切割,如PC1(Proprotein convertase 1,前蛋白转化酶1)、trypsin(胰蛋白酶)、martiptase(基质蛋白酶)、Cathepsin B(组织蛋白酶B)等等。

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SARS-CoV-1 、SARS-CoV-2 S1/S2位点多肽在不同蛋白酶作用下的水解效率对比图

相关论文:
Proteolytic Cleavage of the SARS-CoV-2 Spike Protein and the Role of the Novel S1_S2 Site
https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30397-7

在小鼠肝炎病毒(MHV)25个以上株系中,S1/S2处切割序列为RRARR的MHV-JHM(MHV-4)、MHV-3是毒力(致病能力)最强的两个株系,它们对BALB/c小鼠(白变种实验室小鼠)的感染致死率接近100%。MHV-JHM具有高度神经毒性,它引发使小鼠瘫痪、死亡的强烈脑炎。S1/S2处切割序列为RRAHR的MHV-A59也是毒力较强的MHV株系但毒力显著弱于MHV-JHM和MHV-3。MHV-JHM、MHV-3的强大毒力很大程度上与S1/S2位处的RRARR切割序列有关。

FIPV(Feline Infectious Peritonitis Virus,猫传染性腹膜炎病毒)是猫传染性腹膜炎的病原体。猫传染性腹膜炎的病变部位不只腹膜,它是猫的一种全身性系统性绝症,在有效药物出现前,感染FIPV的猫一年感染死亡率为100%。FIPV也具有大脑、中枢神经系统(CNS)感染、侵犯能力,可导致猫脑膜炎。

RRARR、RRAR的高效酶切特性和强大促膜融合能力(除了介导病毒包膜-细胞膜融合外,还可诱导宿主细胞间发生膜融合形成合胞体)可能有助于病毒突破血脑屏障(blood-brain barrier),感染、侵犯宿主大脑和中枢神经系统。MHV-JHM、MHV-3、FIPV都具有大脑、中枢神经系统侵犯能力,都可能引发脑炎、脑膜炎及其它大脑、神经损伤。S1/S2处的RRAR切割序列可能是SARS-CoV-2具有大脑、神经系统侵害能力的结构因素之一。

小鼠是病原体/病毒研究中使用最广泛的实验室动物,MHV被长期作为冠状病毒研究的模型系统,是研究最为广泛、最为深入的一类病毒;在20多个MHV株系中,被研究最多的三个株系是MHV-JHM、MHV-3、MHV-A59;猫冠状病毒(FIPV、FECV)可能是仅次于鼠冠状病毒,被研究次多的一类动物冠状病毒。但是,自疫情发生至今,“大牌”病毒学家、重量级媒体们一直避而不谈,一直未告知公众,SARS-CoV-2 S1/S2处RRAR切割序列,与MHV-JHM、MHV-3、FIPV、FECV S1/S2处RRARR(、RRAR)切割序列的显著关联和相似性。


2、异常的PRRA插入及FCS


虽然很多冠状病毒、非冠状病毒具有furin切割位点(FCS),但是,SARS-CoV-2 S1/S2处的FCS及RRAR切割序列极不正常,这是因为,与SARS-CoV-2演化关系较近的冠状病毒无一具有FCS,更无一具有RRAR切割序列;具有FCS的冠状病毒全都与SARS-CoV-2 演化关系极远。具体而言:

1)、在SARS-CoV-2 所属的β谱系B支系(乙型冠状病毒属Sarbe亚属),只有一种病毒具有FCS,就是SARS-CoV-2;

2)、只有极少数蝙蝠冠状病毒具有FCS(少数例外之一是伏翼蝠冠状病毒BatCoV-HKU5);

3)、所有与SARS-CoV-2 spike蛋白同源性大于40%的冠状病毒的Spike都不具有FCS(当然更不会具有S1/S2处的RRAR切割序列)。

spike蛋白同源性,就是spike蛋白aa序列(氨基酸序列)相似度。第3点是华中科技大学同济药学院October 05, 2020 iScience论文的生物数据库搜索、比对结论。

论文原文:
It was found that all Spike with a SARS-CoV-2 Spike sequence homology greater than 40% did not possess a furin cleavage site

Furin:  A Potential Therapeutic Target for COVID-19
https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30834-8


SARS-CoV-2的RRAR切割序列由其特有的四氨基酸插入PRRA(脯氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸)的后三个氨基酸RRA与其后的精氨酸R组成,这个精氨酸是S1亚基的最后一个氨基酸。

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部分β谱系B支系冠状病毒S1/S2位点附近的aa序列比对

上图显示了SARS-CoV-2 特有的PRRA插入、基本furin切割序列RRAR、长furin切割序列RRARSVAS。长furin切割序列RRARSVAS下一篇文章还会再涉及。

下图显示了更多β谱系B支系冠状病毒S1/S2位点附近的aa序列。


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β谱系B支系部分人类、果子狸、貉、穿山甲、蝙蝠冠状病毒局部氨基酸序列比对


由图可见,SARS-CoV-2的PRRA插入在同支系冠状病毒中极为突兀、异常。

再从进化树(系统发育树)视角对比一下SARS-CoV-2 与其它冠状病毒的S1/S2处的aa序列:


SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1毒株)与进化树中冠状病毒S1/S2附近的aa序列比对

SARS-CoV-2异常的PRRA插入在上图中更显突兀、刺眼;上面两个图中,S1/S2处具有furin酶切位点(FCS)的冠状病毒只有SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2的四氨基酸插入PRRA在β谱系B支系冠状病毒pike蛋白中是独一无二的,这个四氨基酸短序列在所有已知冠状病毒Spike蛋白中,甚至在所有已知病毒各蛋白中也极有可能是独一无二的。已有许多论文做过生物数据库搜索、匹配研究,但未见有论文报告、指出,在任何其它病毒某蛋白中也存在PRRA序列。下一篇文章将说明,虽然不存在于其它病毒之中,但SARS-CoV-2特有的四氨基酸插入PRRA及其延长的六氨基酸序列PRRARS却存在于两种人类蛋白中。

(未完待续)

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