周昌是沛縣人， 和堂兄周苛一起做泗水郡的獄吏， 劉邦起事後， 攻佔泗水郡， 於是周昌和周苛就跟隨了劉邦。 劉邦任命周昌為掌權官， 周苛為客卿。 他們隨漢王入關後， 周苛升為御史大夫，而周昌則做了負責京城守衛的中尉。 

楚漢相爭時， 項羽把劉邦圍困在了荥阳城， 漢王把周苛留下守城，自己帶入突圍逃走， 城破， 項羽要周苛投降為楚將， 周苛大罵項羽說：你應該趕快投降漢王，否則你必成為漢王的階下囚， 項羽大怒， 用水把周苛給煮了。 劉邦拜周昌為御史， 後來打敗項羽， 和蕭何，曹參一同被封， 周昌被封為汾陰侯； 周苛的兒子因為父親的死， 被封為高景侯。

周昌為人堅持原則， 敢於進言， 這一點，連蕭何和曹參都不如他。 周昌曾經在劉邦休息的時候前去奏事， 看見劉邦和戚妃正在親熱， 於是趕緊離開， 劉邦氣得追上周昌，騎在他的脖子上， 問他， 我這個皇帝做的怎麼樣？ 周昌抬頭說道： 你和桀紂差不多。 劉邦大笑， 但是心中還是忌憚周昌。 

劉邦欲廢太子， 想立戚妃之子如意為太子， 大臣都勸阻，但是劉邦不聽，後來還是靠著張良的計策保住了太子。 周昌也極力勸阻劉邦，劉邦問他理由， 周昌本來就口吃，加上心急， 就說： 我講不清楚，但是我知道這件事是不可以的， 皇上如果廢了太子，我是絕對不會同意的。 皇上氣得笑了起來。 呂後在帷幕後面聽到他們的對話，就給周昌跪了下來，感謝他道： 如果沒有您， 太子肯定被廢了。

劉邦立戚妃的兒子如意為趙王， 但是劉邦擔心自己死後， 呂後會殺了趙王。 周昌手下有一個負責皇帝玉璽的官員叫趙堯， 有人提醒周昌，這個趙堯雖然年輕，但是能力出眾， 將來一定會取代您的位置， 周昌笑到， 一個毛孩子，有什麼值得擔心的。 不久， 趙堯伺候劉邦，見劉邦悶悶不樂， 就問道：聖上悶悶不樂，莫非是擔心趙王如意的安危？ 劉邦說，是。 趙堯於是說，您可以給趙王安排一個份量重一點的丞相， 這樣呂後和眾大臣都有所忌憚，這樣可以保全趙王。 並且說周昌是一個合適的人選。 劉邦於是召見周昌，對他說，我有一件事麻煩你， 請你做趙國丞相輔佐趙王。 周昌流淚道，我一直跟隨您， 今天為何把我趕走呢？ 劉邦道： 我實在是擔心趙王， 實在也沒有其他人比你更合適， 你就委屈一下吧。

周昌走後， 劉邦拿著周昌的御史大夫印把玩， 念道： 誰可以做御史大夫呢？ 一眼看到趙堯， 就說：沒有人比他合適了， 於是任命趙堯接任周昌的位置。 

劉邦死後， 呂後派人召趙王入朝， 周昌告訴趙王不要去，就說生病了。 如此三次， 周昌就是不讓趙王進京。 呂後有點害怕，於是派人將周昌召回， 一見面就大罵周昌，你不知道我和戚氏有仇嗎？ 你怎麼敢不讓趙王回來。 周昌前腳一走， 呂後就派人宣召趙王入朝， 趙王果然回來了， 他在京城不到一個月，就被呂後毒死。 周昌也稱病不上朝， 三年之後， 就死了。 

後來呂後聽說，是趙堯出的主意，讓周昌做趙王的丞相， 就罷了趙堯的官問罪。