本文是
谁设计、制造了新冠病毒（三 上）

续文的一部分，为避免续文篇幅过长，现将这部分内容摘出来另成一文。

冠状病毒刺突蛋白RBD中有五个重要位点，这五个位点上的氨基酸残基决定刺突蛋白的ACE2结合能力，进而决定冠状病毒通过结合ACE2受体进入、感染细胞的能力，它们被称为（ACE2相关的）RBD关键氨基酸残基，简称RBD关键氨基酸或RBD关键残基。RBD即受体结合域（Receptor Binding Domain），它是冠状病毒刺突蛋白（spike protein，简称S蛋白）S1亚基的一部分。

“谁设计、制造了新冠病毒（三 上）”指出：新冠病毒的RBD关键氨基酸借鉴自蝙蝠冠状病毒rs3367（WIV1），新冠、rs3367（WIV1）的5个RBD关键氨基酸三个相同，另有一对理化属性高度相似。

下面是Ralph S. Baric（团队）研究RBD关键氨基酸的四个论文实例，前两篇论文的介绍较长，读者可根据个人兴趣择要阅读、跳跃阅读。

论文B-1

2007年12月19日，Ralph S. Baric领导的团队在Journal of Virology（病毒学杂志）在线发表了如下论文：Mechanisms of Zoonotic Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Host Range Expansion in Human Airway Epithelium（人畜共患SARS冠状病毒在人气道上皮中扩大宿主范围的机制）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2258931/
https://journals.asm.org/doi/10.1128/JVI.02041-07

这篇论文需要介绍的内容颇多，展开之前，先概括一下论文的两大要点：
1、果子狸冠状病毒SZ16不能感染人类和灵长类动物；人为替换SZ16的第三关键氨基酸，将所得中间病毒放到人气道上皮中培养，促其进一步发生适应性突变，得到了两种可跨物种感染、传播的冠状病毒，这两种病毒都能感染人气道上皮细胞和灵长类动的Vero E6细胞。

2、深入研究了冠状病毒RBD与hACE2的作用机制，分析、解读了RBD关键氨基酸替换、变异，如何影响、改变ACE2结合能力的内在机理。

下面看论文具体细节。

论文病毒改造的原材料之一是果子狸（civet，有时译作麝香猫）类SARS冠状病毒SZ16（SARS-CoV SZ16），它分离于SARS疫情期间，分离自中国广东地区动物市场中的果子狸。

SARS病毒既能感染人类，也能感染果子狸，但SZ16只能感染果子狸，不能感染人类。为解读二者感染能力不同的内在机制，论文列出了SZ16、两种SARS流行病毒株SARS Urbani、SARS GD03三者刺突蛋白的所有氨基酸差异，见下图：

Urbani、GD03、SZ16的刺突蛋白氨基酸差异

图中蓝色标示动物来源的氨基酸（与SZ16中氨基酸一致的氨基酸），黄色标示SARS疫情早期出现的氨基酸，橙棕色标示疫情中期出现的氨基酸，红棕色标示疫情晚期出现的氨基酸。

SZ16与SARS Urbani有18个刺突蛋白氨基酸差异，其中16个不同氨基酸位于S1亚基，5个位于RBD，二者有两个不同RBD关键氨基酸（见上图中加粗加黑的第479、487氨基酸）。
刺突蛋白包括S1亚基、S2亚基两部分，S1亚基是受体结合亚基，S2亚基是膜融合亚基，RBD即受体结合域是S1亚基的一部分。

SARS Urbani是分离于SARS疫情晚期，分离自美国的一个SARS病毒株；

SARS GD03是更晚出现的SARS病毒株，它分离于2004年1月疫情再次零星出现时，分离自一位散发广东患者。

2002~2003年的SARS疫情发生于2002年11月16日－2003年9月2日，高峰期为2002年11月16日－2003年7月16日。

如前所述，SZ16与SARS Urbani有两个RBD关键氨基酸不同。论文将证明，以SZ16的刺突蛋白为原材料，通过改变其RBD关键氨基酸，可以改造、培育出有人体细胞感染能力的新病毒。具体的实施过程如下。

1、用SZ16的刺突蛋白和SARS Urbani的骨架（刺突蛋白外部分）合成了嵌合病毒icSZ16-S。
合成嵌合病毒icSZ16-S的更多细节是这样的：用SZ16刺突蛋白部分的基因序列，和SARS Urbani骨架部分的基因序列，拼出一个嵌合基因序列，而后基于嵌合基因序列，使用反向遗传平台合成嵌合病毒的cDNA、RNA，将所得RNA电穿孔释放到培养细胞中，利用RNA的复制能力，最终在培养细胞中收获嵌合病毒的活性毒株。
基于基因序列合成病毒cDNA、RNA，收获病毒毒株，这是反向遗传平台的基本功能。
嵌合病毒icSZ16-S的刺突蛋白来自SZ16，骨架来自SARS Urbani。实验证明，和SZ16一样，icSZ16-S既不能感染Vero E6细胞（非洲绿猴肾细胞系细胞），也不能感染HAE细胞（人气道上皮细胞）。

注：
ic：infectious cDNA，ic前缀代表病毒是反向遗传平台合成的有生物活性的实验室冠状病毒。SZ16-S表示嵌合病毒icSZ16-S的S蛋白来自SZ16，S蛋白即Spike蛋白，也就是刺突蛋白。
HAE细胞：human airway epithelium cells，人气道上皮细胞，包括纤毛上皮细胞、非纤毛上皮细胞以及杯状细胞。

2、接下来要做RBD关键氨基酸的替换了。研究者将icSZ16-S刺突蛋白的第479氨基酸--赖氨酸K替换为天冬酰胺N（亦称为天门冬酰胺），人为制造了一个氨基酸突变K479N。赖氨酸K是SZ16的第479氨基酸，天冬酰胺N是SARS的第479氨基酸，第479氨基酸是SARS及SZ16五个RBD关键氨基酸中的第三个。因此，K479N就是将icSZ16-S的第三关键氨基酸替换为SARS的第三关键氨基酸。

SZ16的第479氨基酸是赖氨酸K，SARS Urbani、GD03的第479氨基酸是天冬酰胺N。

3、对icSZ16-S施以K479N替换得到了另一个改造病毒：icSZ16-S K479N（要使用反向遗传平台，基于替换后的基因序列将其合成）。简明地说，把icSZ16-S 的479氨基酸由赖氨酸K替换为天冬酰胺N，就得到了icSZ16-S K479N。实验证明，相比icSZ16-S，icSZ16-S K479N对Vero E6细胞和HAE细胞的感染能力有所“进步”，它能感染Vero E6细胞和HAE细胞（人气道上皮细胞），不过只能在两种细胞中低水平地复制，衰弱地传代。

4、为提升icSZ16-S K479N对HAE细胞的适应能力，研究者将其接种到人气道上皮组织中，按一定的策略、方式进行培养，并在其反复传代的过程中加以筛选优化。

培养、传代、筛选的第8天，得到了一个新病毒icSZ16-S K479N D8。相比icSZ16-S K479N，D8发生了一个适应性变异Y442F，即，其刺突蛋白第442氨基酸由酪氨酸Y变异为苯丙氨酸F；

培养、传代、筛选的第22天，又得到了一个新病毒icSZ16-S K479N D22。D22在Y442F变异的基础上，又发生了另一处适应性变异L472F，即，其刺突蛋白第472氨基酸由亮氨酸L变异为苯丙氨酸F。

刺突蛋白的第442氨基酸是SARS和SZ16的第一个RBD关键氨基酸，第472氨基酸是它们的第二个RBD关键氨基酸。也就是说，人为替换icSZ16-S的第三RBD关键氨基酸后得到的中间病毒icSZ16-S K479N，在实验室环境下的人气道上皮组织中，又发生了另外两个RBD关键氨基酸，第一、第二RBD关键氨基酸的适应性突变。

相关病毒RBD关键氨基酸对照表，表中展示了K479N替换、Y442F变异、L472F变异所涉及的RBD关键氨基酸

有一个小小的巧合，新冠病毒、WIV1病毒、icSZ16-S K479N D22病毒的第二个RBD关键氨基酸都是苯丙氨酸F。

新冠、WIV1、SARS、D22四病毒RBD关键氨基酸对照表

论文以四组体外细胞实验证明：
1、icSZ16-S K479N D22和icSZ16-S K479N D8都能有效感染HAE细胞、Vero E6细胞、DBT-hACE2细胞，并在细胞中有效复制。
2、D8在三种细胞中的复制能力或多或少弱于D22，D22在三种细胞中的复制能力又或多或少弱于icSARS（使用反向遗传平台合成的SARS流行毒株Urbani的克隆毒株）。
3、icSZ16-S K479N在HAE细胞和DBT-hACE2中的复制能力低下，复制滴度与D22、D8相差好几个数量级（即D22、D8在两种细胞中的复制能力大大强于K479N）。
4、icSARS、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D8、icSZ16-S K479N D22都不能感染未转基因的普通DBT细胞。

icSARS、K479N、D8、D22对HAE、Vero E6、DBT-hACE2、普通DBT细胞的感染实验数据图。
横坐标：感染后时间，单位为小时；纵坐标：细胞培养物中的病毒滴度，单位为PFU/ml。

注：
PFU，Plaque-forming unit，单位体积的病毒形成的空斑数，是代表有活性的病毒粒子浓度的单位。空斑(Plaque)是病毒诱导宿主细胞裂解形成的点状物，可通过显微镜观察。
DBT-hACE2是Ralph S. Baric团队设计、制造的一种表达hACE2的转基因小鼠DBT细胞，其细胞的跨膜糖蛋白--ACE2受体被转基因为hACE2。
DBT：Delayed Brain Tumor，延迟脑肿瘤；小鼠DBT细胞，即小鼠延迟脑肿瘤细胞，或称为小鼠星形细胞瘤迟发性脑瘤细胞。

论文还以小鼠体内实验证明：D8和D22还能感染BALB/c小鼠（白变种实验室小鼠）的肺细胞，并在小鼠肺中良好生长、复制，不过，它们都不会使BALB/c小鼠产生临床疾病症状。

可见：
1、D8和D22是具有跨物种感染能力的病毒，它们能有效感染人气道上皮细胞，灵长类动物的Vero E6细胞，小鼠的肺细胞。
2、通过替换、改造、改变RBD关键氨基酸，可以改变刺突蛋白的ACE2结合能力，改变冠状病毒的细胞感染能力，扩大其宿主范围，可以将不能感染人类，不能跨物种感染的冠状病毒改造为可感染人类，能够跨物种感染的冠状病毒。早在2007年，Ralph S. Baric就已成功尝试了相关技术。

论文使用蛋白质结构设计、预测工具Rosetta Design生成了SZ16、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D8和icSZ16-S K479N D22等病毒的RBD结构模型，并将这些结构模型叠加到SARS Urbani RBD与hACE2相互作用的晶体结构模型上，得到了上述四种病毒与hACE2相互作用的晶体结构模型。

论文借助晶体结构模型研究了病毒RBD与hACE2的作用、结合机制，通过对照这些病毒刺突蛋白第442、472、479、487四个位点的氨基酸差异及与hACE2的作用差异，解读了氨基酸差异影响hACE2结合能力的机理，解释了这些病毒的不同细胞感染能力。上述四个氨基酸是相关各病毒的第一、第二、第三、第四RBD关键氨基酸；论文未对照这些病毒的第五RBD关键氨基酸，即刺突蛋白的第491氨基酸，因为该位点的氨基酸极为保守，论文中各病毒的第五RBD关键氨基酸全都相同，都是酪氨酸Y。具体解读细节见下（供有兴趣者参考，普通读者可跳过）：
a）SZ16与hACE2作用的晶体模型图B显示，SZ16的第479氨基酸残基—Lys479（赖氨酸K），似乎与邻近的两个hACE2氨基酸残基Lys31、His34（His代表组氨酸）存在碰撞（静电排斥），导致SZ16的刺突蛋白不能与hACE2良好结合。图B中Lys31和His34周围的点密集团块为深褐色，模型中的深褐色团块表示相应的hACE2残基与附近的RBD残基存在冲突（静电排斥或碰撞）。

b）icSZ16-S K479N与hACE2作用的晶体模型图C显示，引入点突变K479N后，即将Lys479 （赖氨酸K）替换为Asn479（天冬酰胺N）后，479位点与hACE2残基的排斥力被消除，使得icSZ16-S K479N的刺突蛋白能够与hACE2结合。图C中Lys31和His34两个hACE2残基周围的团块为浅绿色，模型中的浅绿色团块表示相应的hACE2残基与周围的RBD残基相互吻合。

c）前面的晶体模型图A显示，SARS Urbani 的两个RBD关键氨基酸残基Tyr442、Asn479各自与不同的hACE2残基发生作用（Tyr442与Lys31相互作用，Asn479与His34相互作用），二对作用互不干扰，互不竞争，因而Urbani刺突蛋白与hACE2的结合亲和力较强；尽管icSZ16 K479N 的442、479残基与Urbani相同，但软件预测（见上面的晶体模型图C），它的Tyr442、Asn479会同时与hACE2残基Asp32发生作用，同时，Tyr442残基还和两个hACE2残基Asp32、Lys31同时发生作用。这种RBD残基与ACE2残基作用时的交叉竞争削弱了RBD与hACE2的结合亲和力，因而，icSZ16 K479N的刺突蛋白虽然能与hACE2结合，但结合能力较弱。

d）icSZ16-S K479N（以下简称K479N）、SARS Urbani二者唯一不同的RBD关键氨基酸是第487氨基酸（SZ16与Urbani有两个不同RBD关键氨基酸479、487），即第四个RBD关键氨基酸（参见前面的“相关病毒关键氨基酸对照表”）。K479N 的第487氨基酸是Ser487（丝胺酸-S），它只与一个hACE2残基Tyr41结合，见晶体模型图C；SARS Urbani 第487氨基酸是Thr487（苏胺酸-T），它独自结合了三个hACE残基，而且没有其它RBD残基交叉竞争与这三个hACE残基的结合，见前面的晶体模型图A（但我在图A中未看到与Thr487作用的三个hACE2残基？？？）。因而Urbani的Thr487 残基与hACE2间的氢键强于K479N 的Ser487 残基与hACE2间的氢键，这是Urbani的刺突蛋白与hACE2的结合亲和力强于K479N的刺突蛋白与hACE2的结合亲和力的另一个原因。

e）如晶体模型图D所示，Rosetta Design预测icSZ16-S K479N D8的Y442F突变消除了icSZ16-S K479N的442、479残基对hACE2残基的交叉竞争，D8的Phe442（苯丙氨酸F442）、Asn479各自与不同的hACE2残基作用（Phe442结合Lys31，Asn479结合His34）；与此同时，它的Ser487残基与hACE2的Tyr41残基间的相互作用和氢键网络保持不变。因此，D8的hACE2结合能力大大提升，它在HAE细胞和DBT-hACE2细胞中的生长（感染、复制）比K479N茁壮得多。

f）仍如晶体模型图D所示，Rosetta Design还预测icSZ16-S K479N D8的Leu472（亮氨酸L472）残基无交叉竞争地同时结合了两个hACE2残基Leu79、Met82（Met代表甲硫胺酸M）；icSZ16-S K479N D22是D8发生L472F突变（亮氨酸L突变为苯丙氨酸F）得到的，如下面的晶体模型图E所示，Rosetta Design预测其Phe472（苯丙氨酸F472）残基将无交叉竞争地同时结合三个hACE2残基Leu79、Met82、Tyr83。Rosetta Design还预测Phe472与这三个hACE2残基间存在强烈的疏水相互作用，进一步加强了彼此的结合。因此，L472F突变增强了D22 RBD与hACE2的结合亲和力，提升了D22对HAE细胞、DBT-hACE2细胞的感染、复制能力（相比D8）。

可见，早在2007年，Ralph S. Baric就掌握了通过RBD关键氨基酸替换、变异，改变ACE2结合能力、细胞感染能力，扩大宿主范围的技术，并深入研究了这一技术的内在机制。

在论文Disscussion部分，研究者意犹未尽地写道：
显然，可能存在多种遗传途径来允许人畜共患病SARS冠状病毒宿主范围的扩大，确定其他接触界面点突变是否能增强人畜共患病病毒对HAE细胞（人气道上皮细胞）的感染将是一件有趣的事情。

所谓的“接触界面点”，是指RBD中与ACE2发生直接接触、作用的14个氨基酸残基，RBD关键氨基酸就是这14个RBD接触残基中对ACE2结合能力起决定作用的五个氨基酸残基。论文人为制造了第三RBD关键氨基酸的K479N突变，上面一段话的言下之意，是可以尝试以制造其它RBD关键氨基酸的人为突变作为病毒改造、培育的起点。

论文B-2

2008年9月1日（Published online 2008 Jun 25），Ralph S. Baric领导的团队在Journal of Virology发表了如下论文：Pathways of Cross-Species Transmission of Synthetically Reconstructed Zoonotic Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus（人畜共患严重急性呼吸综合症冠状病毒的跨物种传播途径）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2519660/
https://journals.asm.org/doi/10.1128/JVI.00818-08

论文B-2是论文B-1研究的后续。

论文研究了7种病毒对3种细胞的感染、复制能力，探讨、解读了病毒的细胞感染、复制能力差异与RBD关键氨基酸-ACE2作用差异之间的内在关联。7种病毒是：
病毒1：论文B-1中的嵌合病毒icSZ16-S，它的刺突蛋白来自果子狸冠状病毒SZ16，骨架来自SARS Urbani；
病毒2：icSZ16-S K479N，它是将icSZ16-S的479氨基酸（赖氨酸K）替换为SARS 的第479氨基酸（天冬酰胺N）得到的病毒；
病毒3：icSZ16-S K479N D22，它是在人气道上皮组织中培养、传代、筛选22天后得到的icSZ16-S K479N的实验室变异体；
病毒4-6：三个SARS病毒株的克隆：icSARS、icCUHK-W1、icGZ02，
icSARS是SARS Urbani的克隆，SARS Urbani是SARS疫情晚期分离自美国的SARS病毒株，
GZ02是SARS疫情早期分离自广州的SARS病毒株，
CUHK-W1是SARS疫情中期分离自香港的SARS病毒株。
病毒7：icGD03-S，它应该是由SARS GD03的刺突蛋白与SARS Urbani的骨架嵌合成的SARS不同毒株的混嵌体。

GD03是更晚出现的SARS病毒株，它是2004年1月疫情再次零星出现时从一位散发广东患者体内分离得到的。
（2002~2003年的SARS疫情发生于2002年11月16日－2003年9月2日，高峰期为2002年11月16日－2003年7月16日）

论文详细考察了7种病毒刺突蛋白（spike）的氨基酸差异，以及刺突蛋白、ACE2的相互作用残基。

图D：相关病毒的spike蛋白氨基酸差异；图E：ACE2、SARS-Urbani的所有接触残基

图D列出了7种病毒间的所有氨基酸差异，并标出了其它6种病毒相对于SARS Urbani的不同刺突蛋白氨基酸个数。如icSZ16-S K479N D22（即图中的SZ16-S K479N D22）有19刺突蛋白氨基酸与SARS Urbani不同（不相同的氨基酸残基背景为灰色）。

图E列出了与SARS Urbani的spike发生接触或作用的所有cACE2（civet ACE2）、hACE2/primate-ACE2（灵长类动物ACE2）氨基酸残基，及与各个ACE2残基发生作用的SARS Urbani的接触残基（氨基酸残基）。

论文B-1研究、实验了相关病毒对HAE细胞（人气道上皮细胞）、Vero E6细胞、普通小鼠DBT细胞、转基因小鼠DBT-hACE2细胞的感染、复制能力。当前论文（B-2）引入了另一种转基因小鼠DBT细胞：DBT-cACE2，它的mACE2（mice ACE2）转基因为cACE2（civet ACE2，果子狸或麝香猫的ACE2）。

论文设计、实施了三组体外感染实验，7种病毒对3种细胞DBT-cACE2 、DBT-hACE2、Vero E6的感染、复制实验数据见下图：

7种病毒对3种细胞的感染复制实验数据图

横坐标是感染后时段，单位为小时；纵坐标是病毒的复制滴度，单位为PFU/ml。

实验结果表明：
1、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D22和icCUHK-W1要么不能在DBT-cACE2细胞中有效复制，要么只能低水平复制（滴度小于10^3）；而其它4种病毒，包括icSZ16-S在内都能在DBT-cACE2细胞中有效复制（滴度大于10^4），见实验数据图中的坐标图A；

2、icSZ16-S不能在DBT-hACE2细胞中有效复制（滴度约为10^2），而其它6种病毒都能在DBT-hACE2细胞中不同程度地复制（K479N复制能力相对最差，滴度略低于10^4），见坐标图B；

3、icSZ16-S不能在Vero E6细胞中有效复制（滴度仅略高于10^2），而其它6种病毒都能在Vero E6细胞中不同程度地复制（滴度大于10^5），GZ02、CUHK-W1、icSARS、icSZ16-S K479N D22这四种病毒在Vero E6细胞中的复制都极为强烈（滴度大于10^7），见坐标图C；

4、icSZ16-S K479N D22对Vero E6、DBT-hACE2的感染、复制能力强于icSZ16-S K479N ；K479N 替换使icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D22获得了对Vero E6、DBT-hACE2的感染、复制能力，但同时使它们丧失了icSZ16-S所具有的对DBT-cACE2细胞的感染、复制能力。

论文还指出：上述7种病毒都不能感染未转基因的普通小鼠DBT细胞。

icSZ16-S、icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D22三者不同物种ACE2结合能力，不同物种细胞感染、复制能力的显著差异是它们RBD关键氨基酸的差异造成的。

相关病毒RBD关键氨基酸对照表

为进一步研究RBD与cACE2、hACE2作用的内在机制，解读RBD关键氨基酸差异对物种ACE2结合能力影响的内在机理，论文使用RosettaDesign和Modeler两种软件构建了4种病毒（SARS Urbani、SZ16、icSZ16-K479N、SZ16-K479N D22）的刺突蛋白与cACE2、hACE2的作用模型（二维、三维结构模型）。以下为论文所作解读（供有兴趣者参考，普通读者可略过）：
1、cACE2、hACE2有两个不同的RBD接触残基（与RBD接触的ACE2氨基酸残基）（cACE2的E30、Y34在hACE2中为D30、H34），模型预测，E30和Y34的附加甲基可能会使cACE2结合界面产生明显的突起（我在模型图B下部的三维图中目测看不出cACE2的明显突起）。模型图A显示，Urbani的RBD能良好适应hACE2的结合界面（三维模型图用浅黄绿色表示与RBD良好吻合的ACE2残基）；模型图B显示，Urbani也能容纳cACE2的表面突起（三维模型图用浅棕色表示与RBD存在冲突，但仍能结合的ACE2残基）。因此，SARS Urbani对人类和civet（果子狸或麝香猫）有双重宿主适应能力。

SARS Urbani与hACE2、cACE2，SZ16与cACE2作用模型

2、如模型图C所示，SZ16 的RBD也能容纳E30、Y34形成的表面突起，因而SZ16 的RBD也可与cACE2结合。

3、如模型图D所示，icSZ16 K479N中的K479N突变（人为替换）引入的479N（天冬酰胺）重塑了SZ16刺突蛋白的结合界面，促进了刺突蛋白与hACE2的结合（论文为什么不提供、对照SZ16 RBD与hACE2的作用模型？）。

icSZ16 K479N与hACE2、cACE2，icSZ16 K479N D22与hACE2的作用模型

4、如模型图E所示，SZ16 K479N  RBD的结合界面因K479N替换而被重塑，它的氨基酸残基（V404、Y440）与cACE2的氨基酸残基（E30、Y34）产生了冲突，无法容纳cACE2的延长突出部分（三维图中的深褐色部分代表RBD残基与ACE2残基间存在难以克服的冲突，难以产生结合的区域）。从而，K479N突变（人为替换）使SZ16 K479N 的RBD获得了结合hACE2的能力，但同时失去了结合cACE2的能力。

5、如模型图F所示，Y442F突变和L472F突变在K479N突变基础上进一步重塑了SZ16 K479N D22的RBD结合界面，大大提高了RBD与hACE2的吻合度和结合效率；

6、如模型图G所示，和SZ16 K479N一样，SZ16 K479N D22的RBD也不能容纳cACE2的延长突出部分，二者无法结合。

icSZ16 K479N D22与cACE2的作用模型

由论文B-1、B-2可知：
1、早在2007年，Ralph S. Baric就通过人为替换RBD关键氨基酸，结合实验室环境下人体组织适应性培养，改造、培育出了能感染人体细胞，并具有跨物种感染、传播能力的冠状病毒。
2、Ralph S. Baric对冠状病毒RBD（特别是RBD关键氨基酸）与不同物种ACE2的作用机制，早在2007、2008年就已经研究得极为深入了。

论文B-3

2015年11月9日，Ralph S. Baric领导的团队在《自然医学》（Nature Medicine）杂志发表了著名的嵌合病毒论文：A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence（一个类似SARS的蝙蝠冠状病毒群显示了产生人类流行疫情的潜力）
https://www.nature.com/articles/nm.3985

论文同时研究了WIV1病毒和RBD关键氨基酸，它也将作为Ralph S. Baric研究rs3367（WIV1）的示例（论文A-1）被介绍。下面从RBD关键氨基酸的角度简单介绍一下该论文。

WIV1在论文中是病毒主角SHC014的对照病毒。论文比较了WIV1、SHC014与SARS的RBD关键氨基酸差异。论文（援引其它论文的实验结果）指出：WIV1虽然有三个RBD关键氨基酸与SARS不同（见下图，二者第1、第2、第4 RBD关键氨基酸不同），但WIV1仍象SARS那样，其刺突蛋白也能有效结合hACE2；论文接着指出，尽管SHC014的RBD关键氨基酸与SARS差异更大，二者的RBD关键氨基酸无一相同，但不能就此断言SHC014的刺突蛋白不能结合hACE2。

SARS、WIV1、SHC014 RBD关键氨基酸对照表

为确定SHC014的hACE2结合能力、人体细胞感染能力，论文使用反向遗传平台，基于SHC014刺突蛋白（的基因序列）与SARS-CoV-MA15骨架（的基因序列）合成了嵌合病毒SHC014-MA15。实验证明，SHC014-MA15能有效感染人气道上皮组织，并在组织细胞内大量复制。这表明，SHC014的刺突蛋白也能有效结合hACE2，和WIV1一样，SHC014也是具有人体细胞进入（感染）能力的特殊蝙蝠冠状病毒。

论文B-4

2016年3月14日，Ralph S. Baric领导的团队在PNAS（美国国家科学院院刊）发表了如下论文：SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence（类SARS冠状病毒WIV1-CoV对人类有潜在威胁）
https://www.pnas.org/content/113/11/3048

论文B-4也同时研究了WIV1病毒和RBD关键氨基酸，它还将作为Ralph S. Baric研究rs3367（WIV1）的示例（论文A-2）被介绍。

论文比较了SARS-WT、SARS-MA15、WIV1三病毒与hACE2直接作用（接触）的14个RBD氨基酸残基，包括五个RBD关键氨基酸残基，见下图A；论文构建、研究了SARS、WIV1的刺突蛋白与hACE2的作用模型，对照了二者第一、第二、第四RBD关键氨基酸残基（对应SARS刺突蛋白的第442、472、487氨基酸）与hACE2的作用细节，见下图B。

图A：WIV1、SARS 14个ACE2直接作用残基对照表；图B：WIV1、SARS 与ACE2的作用模型对照图

最后是对图A、图B的一些补充说明：
1、图A中的氨基酸序号基于SARS，WIV1中的对应氨基酸序号应+1。
2、SARS-WT，即SARS-CoV wild type，指SARS病毒的野生流行毒株（它应该具体对应SARS Urbani）。
3、SARS-MA15，即SARS-CoV MA15，Ralph S. Baric等人实验室培育的SARS-CoV小鼠适应性变异体。SARS-CoV能感染小鼠细胞，但不会使小鼠产生临床疾病症状，SARS-CoV MA15则可使小鼠严重致病并（100%）致死。
4、图A中，SARS-MA15与SARS-WT不同的氨基酸用深红背景色标示，WIV1-CoV与SARS-WT不同的氨基酸用深蓝背景色标示，紫红色长条框标出了三病毒的5个RBD关键氨基酸残基。
5、图B左图是SARS刺突蛋白S1亚基（也叫受体结合亚基，S1亚基前端为RBD）与hACE2的作用模型，图B右图是WIV1刺突蛋白S1亚基与hACE2的作用模型。
左右两图右侧的双螺旋结构是hACE2，其上的橙黄色部分是hACE2的RBD接触残基；
左右两图左侧是两病毒刺突蛋白的S1亚基，SARS的S1亚基以灰黑色表示，WIV1的S1亚基以蓝色表示。两个红色含环图案对应两病毒相同的RBD关键氨基酸残基（479、491），紫色圆圈标出了二者不同的三个RBD关键氨基酸残基（442、472、487）与hACE2残基的作用情况。